客人列|2021年11月3日

如何减轻“高风险”宿主细胞蛋白带来的风险

生物素

冠状病毒棘突蛋白iStock-1275227601

宿主细胞蛋白(HCPs)是过程相关杂质,可能与生物制药产品共净化。其中一些是有问题的,可被视为高风险的,包括具有免疫原性、生物活性或酶活性,有可能降解配方中使用的产品分子或赋形剂。一些已被证明难以通过净化去除。

目前已知的HCP直接影响患者安全的案例很少,那么为什么生物制药行业要担心这些高风险HCP呢?可以采取什么方法来了解铜化的起源,并解决这些高风险HCPs?

为了回答这些问题,BioPhorum Development Group(BPDG)HCP Workstream启动了26家公司团队之间的合作,围绕高风险HCP建立行业联盟。结果是一篇完整的参考论文,名为“高宿主细胞蛋白(HCPs):一个多公司协作视图,本文对此进行了总结。

HCP工作流程建立在先前跨行业小组的基础上,这些小组提出了评估HCP杂质的建议,并形成了对监管机构要求的共识。

一个小组还进行了文献检索,以了解高风险HCPs的影响,并讨论成员公司的经验。这些产品主要是由中国仓鼠卵巢(CHO)细胞生产,并通过Protein a亲和柱和额外的抛光步骤纯化的生物制药产品。

下游加工中常见的HCP

CHO表达系统是生物制药生产中最常见的哺乳动物系统之一,因为它能够产生与人类类似的具有翻译后修饰的复杂蛋白质。已经确认了6000多个CHO HCPs。

下游处理通常包括蛋白质A亲和纯化,然后进行额外的抛光步骤,以进一步去除聚集物、电荷变体、HCP和宿主细胞DNA。对蛋白质A层析后的HCP进行的文献检索显示,在生物制药行业中发现了许多相同的HCP。尽管CHO细胞系、上游过程或下游过程存在差异,但所鉴定的HCP相似。

该小组从已发表的文献中汇编了这些常见HCP的列表,可用于参考在不同加工步骤中发现的HCP。BioPhorum文档中的表格中列出了这些蛋白质,该表格提供了每种蛋白质的分子量、pI、氨基酸数量以及与Uniprot数据库的直接链接。摘录见表1。

表1:在不同处理步骤中发现的常见HCPs的综合列表(仅摘录)

曹蛋白质

分子量(kDa)

pl

UniProt注册号。

氨基酸数量

40S核糖体蛋白SA(RPSA)

19.7

9.4

G3HQX0

179

酸性核糖体蛋白

30.6

8.9

G3HKG9

280

78 kDa葡萄糖调节蛋白(GRP78, BiP)

72.4

5.1

G3I8R9

654

肌动蛋白,细胞质1(ACTB)

41.7

5.2

P48975

375

α-烯醇化酶(2-磷酸-D-甘油酸氢裂解酶)

15.5

5.0

G3I0W1

139


BioPhorum的HCP可搜索数据库将继续更新常见的HCPs及其特征(见表2)。不同HCPs的身份可能对公司在开发下游流程或可能精炼现有净化平台时起到指导作用。

表2:常见HCP的数据库提取-仅组织蛋白酶CHO

曹蛋白质

UniProt注册号。

分子量(kDa)

pl

氨基酸数量

组织蛋白酶B(有线电视)

G3H0L9

37.5

5.7

339

组织蛋白酶D(CatD)

G3I4W7

44.1

6.5

408

组织蛋白酶E(美食)

G39

42.2

4.7

388

组织蛋白酶L(CatL)

G3INC5

37.3

6.8

333

组织蛋白酶Z(卡茨)

Q9EPP7

34

7.5

306


保健品的分类

将有问题的HCP分类为免疫原性高风险或低风险可能很困难。风险取决于许多因素,包括药物适应症、给药途径、给药频率和每剂量给药的HCP量。

将有问题的HCP分类为高风险的方法可以基于HCP与产品的共净化能力、在下游加工中出现的频率、其修饰或降解药物和/或赋形剂的能力以及其潜在的免疫原性。

使用这种方法,HCP可根据其潜在影响分为四大类:产品质量、配方、人体直接生物功能和免疫原性。通过广泛的文献检索和HCP工作流程的工作经验,编制了一份高风险HCP列表,并根据其影响进行分类(这些列表在BioHorum出版物和数据库中的表格中列出)。

工作流程调查结果

在彻底的文献检索和BPDG团队讨论后,对团队进行了调查,以了解有问题或高风险HCP的成员公司的集体经验。主要调查结果摘要如下:

  1. 69%的公司表示,他们在药物生产过程中遇到了个人HCP的问题。
  2. 磷脂酶B样2是识别/检测和检测后清除率最高的HCP。其他确定的HCP包括脂蛋白脂肪酶、组织蛋白酶(D、B和L)和溶酶体磷脂酶A2。大多数受访者表示,他们能够显示这些HCP的清除率。
  3. 大多数公司使用针对HCP的质谱(MS)或酶联免疫吸附试验(ELISAs)来识别和测量单个HCP。较少的受访者使用酶/活性测定,只有1人表示使用凝胶切除后液相色谱-质谱法。
  4. 大多数受访者使用一种或多种HCP ELISA方法进行释放试验,以量化原料药中的HCP总量,少数受访者使用了MS定量、陀螺仪和中尺度发现等技术。
  5. 大多数受访者将MS用于流程开发支持;其他人将其用于临床和非临床原料药/药品样品。此外,64%的公司使用相对量化,其余公司使用绝对量化。
  6. 67%的受访者在分析前没有富集HCPs,而17%的人富集了,其余的人使用沉淀。在消化方法上,13家公司使用胰蛋白酶,4家公司使用胰蛋白酶+赖氨酸C。
  7. 45%的公司表示,他们没有收到有关总体HCP和单个HCP分析检测策略的监管反馈;36%的人说他们做了。其余的人表示,作为监管反馈的一部分,要求进行二维覆盖。

对业界的建议

在鉴别出的HCP及其对治疗过程或患者的影响之间建立联系是具有挑战性的。因此,行业必须制定全面的分析策略,以适当地测量已知的HCP杂质,如果被确定为高风险,则制定控制策略来监控和/或消除这些杂质。为达到这些目标,建议如下:

  1. 开发全HCP免疫分析所需的关键试剂应该仔细生成并鉴定。
  2. 工艺特定HCP的关键抗体试剂应使用额外的正交方法进行评估,如2D-gels/westerns和/或抗体亲和力提取,然后使用MS。
  3. 应常规进行总HCP ELISA,以确定工艺样品中HCP的水平。
  4. 建议采用正交方法和/或额外单独的HCP检测方法,以确保产品纯度。
  5. 如果单个HCP被确定并认为具有潜在高风险:
    1. 为了更好地了解HCP水平及其潜在影响,可能需要开发一种监测已知杂质的特异性免疫分析方法或靶向MS分析方法。
    2. 如果鉴定的杂质具有酶活性,可以开发一种活性分析来指导工艺和产品开发,以监测、去除和/或失活蛋白质。
    3. 免疫原性评估可通过电子方法进行,如果电子预测显示免疫原性风险较高,则可进行体外比较免疫原性评估。
    4. 毒理学输入可能对评估临床风险有价值。

HCP的检测、定量和从最终的生物治疗过程中去除可能是复杂的。BioPhorum列出的高风险或有问题的HCPs可以成为公司在CHO细胞中开发生物治疗药物的资源。它将它们分为四个主要类别根据其对产品质量的影响,制定,直接在人类生物功能,和免疫原性(见表3)。如果一个HCP高危险名单被确定在一个过程中,企业应该遵循推荐行动,执行风险评估,并建立一个HCP控制策略。

表3:高风险HCP根据其影响进行分类(仅摘录)

蛋白质的名字

作用

影响

类型的影响

选择引用

78 kDa葡萄糖调节蛋白(GRP78;BiP)

内质网的蛋白质折叠与质量控制

药品质量

聚合的药物

Farrell等人,2015年;刘等人,2019年;瓦伦特等人,2015年

α应承担的烯醇酶

催化2-磷酸甘油酯脱水为磷酸烯醇式丙酮酸

药品质量

药物修饰

瓦伦特等人,2015;张等人,2014

附录A5(ANXA5)

与磷脂高度亲和性结合,作为细胞凋亡的标志

免疫原性

免疫原性反应

Fukuda等人,2019年;Gilgunn & Bones, 2018年

C‐X‐C基序趋化因子3 (CXCL3)

具有潜在致瘤特性的细胞因子

人体的生物功能

免疫原性反应

Gilgunn&Bones,2018年;吉尔冈等人,2019年

羧酸酯酶(CEB)

催化含有酯或酰胺的底物裂解成醇和羧酸

配方

聚山梨酯的降解

McShan等人,2016年;张等人,2020年


各公司在其产品和工艺开发过程中可能会遇到特殊情况,必须根据具体情况进行HCP风险评估。我们希望这一合作将指导行业对高风险HCP进行有针对性的表征,并主动缓解这些HCP在生物产品中造成的风险。